研究概述    

内切-1,3-岩藻聚糖酶（EC 3.2.1.211）是岩藻聚糖研究的重要工具，但其基因不明确，成为限制该酶克隆表达与高效获取的瓶颈。针对上述问题，本研究融合比较转录组学筛选、分子生物学克隆表达、糖组学功能验证，从海洋微生物基因组中成功发掘出一条内切-1,3-岩藻聚糖酶基因，首次实现了内切-1,3-岩藻聚糖酶的异源表达与高效获取；基于该类酶序列与功能的新颖性，构建了一个全新的糖苷水解酶家族——糖苷水解酶第168家族（GH168）。该家族的建立为岩藻聚糖酶的研究建立了新起点，并有望为岩藻聚糖的研究与分子剪裁提供丰富工具。    

研究背景    

岩藻聚糖，也称为岩藻聚糖硫酸酯、岩藻多糖、褐藻糖胶，因其丰富的生理调节功能及良好的生物材料性能，近年来受到广泛关注，是多糖研究领域的热点。岩藻聚糖中的糖苷键主要包括α1,3岩藻糖苷键及α1,4岩藻糖苷键。岩藻聚糖酶是岩藻聚糖研究的核心工具酶，其中内切-1,4-岩藻聚糖酶（EC 3.2.1.212）作用于α1,4岩藻糖苷键，首条基因于2006年被解明，基于该基因糖苷水解酶家族GH107得以构建，目前已有8条内切-1,4-岩藻聚糖酶序列得到研究。内切-1,3-岩藻聚糖酶（EC 3.2.1.211）切割α1,3岩藻糖苷键，该类酶的野生型已发现超50年以上，但其基因至今未见报道，导致该类酶的克隆表达与高效获取无法实现。

该研究从可利用多种岩藻聚糖的海洋细菌-Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127T的基因组出发，采用比较转录组学技术，筛选出岩藻聚糖诱导下显著上调表达的基因序列25条；对候选序列进行克隆表达获得蛋白，并以仅含α1,3-岩藻糖苷键的岩藻聚糖为底物，对蛋白潜在的α1,3-岩藻糖苷键水解活力进行验证，最终验证获得一条具有目标活力的酶，命名为FunA。    

反应进程分析表明，FunA以随机内切的方式作用于岩藻聚糖。以超高效凝胶排阻色谱-质谱联用技术结合核磁共振分析，证明FunA特异性切割2-O-硫酸酯化与非硫酸酯化岩藻糖残基之间的α1,3糖苷键。FunA在甘油、甲醇及L-岩藻糖为受体的反应体系中展现出转糖基活性，提示其保持型的作用机制。定点突变实验表明D206与E264是FunA重要的活性功能位点。

基于FunA序列开展生物信息学挖掘，并对其同源蛋白进行克隆表达与酶活验证，证实FunA的同源蛋白普遍具有内切-1,3-岩藻聚糖酶活性。因FunA及其同源蛋白不具有先前报道的糖苷水解酶家族催化域，且功能上具有新颖性，作者提议建立了一个全新的糖苷水解酶家族（CAZy编号为GH168）。    

本研究第一作者为博士研究生申晶晶。经费来源：国家自然科学基金面上项目（31671883）、中央高校基本科研业务费专项（201941005）及教育部霍英东教育基金青年教授基金（171024）。